Основно съдържание
Гел електрофореза
Класна стая на GoogleТехника, използвана за разделяне на ДНК фрагменти и други макромолекули по размер и заряд.
Ключови точки:
- Гел електрофореза е техника, използвана за разделяне на ДНК фрагменти по размер.
- ДНК пробите се зареждат в кладенци (вдлъбнатини) в единия край на гела и се пропуска електричен ток, под чието действие те се придвижват през гела.
- ДНК фрагментите са отрицателно заредени, така че се движат по посока на положителния електрод. Понеже всички ДНК фрагменти имат едно и също количество заряд на единица маса, малките фрагменти преминават през гела по-бързо от големите.
- Когато един гел бъде оцветен с ДНК-свързващ се оцветител, ДНК фрагментите могат да се видят като ленти, всяка от които представлява група от ДНК фрагменти с еднакъв размер.
Въведение
Предположи, че току-що извърши PCR реакция, създавайки много копия от един целеви ДНК регион. Или вероятно направи ДНК клониране, опитвайки се да "поставиш" един ген в кръгов ДНК плазмид.
Сега искаш да провериш и да видиш дали PCR е свършила работа или дали плазмидът ти има правилния ген в себе си. Каква техника можеш да използваш, за да визуализираш (да наблюдаваш директно) фрагментите ДНК?
Гел електрофореза
Гел електрофорезата е техника, която се използва за разделяне на ДНК фрагменти (или други макромолекули като РНК и протеини) въз основа на размера и заряда им. Електрофорезата включва пропускане на електричен ток през един гел, който съдържа интересуващите ни молекули. Въз основа на размера и заряда им молекулите ще преминат през гела в различни посоки или с различна скорост, което позволява разделянето им една от друга.
Всички ДНК молекули имат едно и също количество заряд на единица маса. Поради това гел електрофорезата на ДНК фрагментите ги разделя въз основа само на размера. Чрез използване на електрофореза можем да видим колко различни ДНК фрагменти са налични в една проба и колко са големи. Можем също да определим абсолютния размер на една част ДНК, като я проучим, сравнявайки я със стандартна "мярка", представляваща ДНК фрагменти, чиито размери знаем.
Какво е гел?
Както подсказва името, при гел електрофорезата се използва гел: парче желеподобен материал. Геловете за ДНК разделяне често са направени от един полизахарид, наречен агароза, който е във вид на сухи, праховидни люспи. Когато агарозата се нагрее в буфер (вода с разтворени в нея соли) и се остави да се охлади, тя образува твърд, леко желеподобен гел. На молекулярно ниво гелът е матрица от агарозни молекули, които се държат в едно от водородни връзки и образуват малки пори.
В единият край гелът се правят вдлъбнатинки, подобни на джобове, които се наричат кладенци, които са местата, където ще бъдат поставени ДНК пробите:
Преди да бъдат добавени ДНК пробите, гелът трябва да бъде поставен в гелна кутия. Единият край на кутията е свързан към един положителен електрод, докато другият край е свързан с отрицателен електрод. Основната част на кутията, където се поставя гелът, се запълва с буферен разтвор, съдържащ сол, който може да провежда електричество. Въпреки че може да не успееш да видиш това в изображението по-горе (благодарение на удивителните ми артистични умения), буферът запълва гелната кутия до ниво, при което едва покрива гела.
Краят на гела с кладенците се поставя към отрицателния електрод. Краят без кладенците (към който ДНК фрагментите ще се придвижат) се поставя към положителния електрод.
Как ДНК фрагментите се движат през гела?
След като гелът е в кутията, всяка ДНК проба, която искаме да проучим (например всяка PCR реакция или всеки рестриктивно смлян плазмид), внимателно се премества в един от кладенците. Един кладенец е запазен за една ДНК стълба – стандартна справка, която съдържа ДНК фрагменти с известни дължини. Комерсиалните ДНК стълби се предлагат в различни диапазони по отношение на размерите, така че трябва да изберем такава с добро "покритие" на диапазона от размери на очакваните фрагменти.
След това се включва захранването към гелната кутия и електричеството започва да протича през гела. ДНК молекулите имат отрицателен заряд поради фосфатните групи в захарно-фосфатната си верига, така че започват да се движат през матрицата на гела към положителния полюс. Когато се подаде напрежение и електричеството преминава през гела, се казва, че гелът тече.
Докато гелът тече, по-късите части ДНК ще преминат през порите на гел матрицата по-бързо от по-дългите. След като гелът е текъл за известно време, най-късите части ДНК ще са близо до положителния край на гела, докато най-дългите части ДНК ще останат близо до кладенците. Най-късите парченца ДНК може да изтекат извън края на гела, ако оставим електричеството да тече твърде дълго (нещо, което определено съм правил!).
Визуализиране на ДНК фрагменти
След като фрагментите са разделени, разглеждаме гела, за да видим какъв размер ленти има върху него. Когато един гел е оцветен с ДНК-свързващо оцветяване и е поставен под UV светлина, ДНК фрагментите ще блестят, което ни позволява да видим ДНК-то в различните места по дължината на гела.
Добре определена "линия" ДНК върху гел се нарича ивица. Всяка ивица съдържа голям брой ДНК фрагменти с еднакъв размер, всички от които са пътували като група до една и съща позиция. Единичен ДНК фрагмент (или дори малка група ДНК фрагменти) няма да е самостоятелно видима върху гел.
Чрез сравняване на ивиците в пробата с ДНК стълбата, можем да определим приблизителния им размер. Например светлата ивица на гела по-горе има размер приблизително
Провери знанията си
Четири ленти са номерирани на гела по-горе. (Лента е коридор, през който ДНК преминава, докато напуска един кладенец).
Коя лента съвпада с всяко описание по-долу?
Разгледай темата извън Кан Академия
Искаш да научиш повече за гел електрофорезата? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.
LabXchange е безплатна, научно-образователна онлайн платформа, създадена от факултета по изкуства и науки на университета Харвард с подкрепата на фондация Amgen.
Искаш ли да се присъединиш към разговора?
Все още няма публикации.